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轉錄組測序助力膠質母細胞瘤的靶向治療機制研究

2019-12-04

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文章題目:Bromodomain inhibitor jq1 induces cell cycle arrest and apoptosis of glioma stem cells through the VEGF/PI3K/AKT signaling pathway

發表期刊:INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY

影響因子:3.571

2019年8月,派森諾生物與吉林大學攜手合作,于INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY雜志上發表了溴結構域抑制劑jq1通過VEGF / PI3K / AKT信號通路抑制神經膠質瘤干細胞的的細胞周期停滯和凋亡的研究成果《Bromodomain inhibitor jq1 induces cell cycle arrest and apoptosis of glioma stem cells through the VEGF/PI3K/AKT signaling pathway》,為膠質母細胞瘤的靶向治療提供新的依據。

研究背景:

多形膠質母細胞瘤(GBM)是最常見的原發性惡性腦腫瘤,盡管近年來出現了多種治療方法,例如手術,放療和化學療法,但膠質母細胞瘤患者的總體生存率并未發生明顯變化。膠質瘤干細胞(GSC),具有自我更新的能力和多能性,并且可以誘導腫瘤發生,對神經膠質瘤發展日益重要。因此闡明控制GSC的分子機制可能為開發針對GBM的靶向治療提供新的信息。而之前的一些研究已經表明,溴結構域和末端外域蛋白,尤其是含溴結構域的蛋白4(Brd4),可能是多種癌癥的治療靶標,但是目前尚不清楚Brd4在多形膠質母細胞瘤(GBM)中的作用和機制。本研究旨在探討Brd4和溴結構域抑制劑JQ1對神經膠質瘤干細胞(GSC)的抗腫瘤作用的潛在機制。

研究方法:

1、 細胞培養和轉染,細胞活力,細胞增殖和自我更新測定,細胞周期分布測定,細胞凋亡測定;

2、 Hoechst 33342染色,免疫熒光,免疫組化實驗;

3、 RNA提取,RT-qPCR,蛋白質提取和蛋白質印跡(western blotting),,RNA-Seq測序和分析

研究結果:

1、Brd4是GBM的潛在治療靶標

用siRNA處理CSC2078,對Brd4表達進行蛋白質印跡分析(圖A和B);用si-NC或siBrd4(20 μM)感染CSC2078細胞。通過CCK-8測定法檢測細胞活力(圖C),通過細胞生長計數測定法評估細胞增殖(圖D)。通過以上等多種實驗結果的綜合分析,確定Brd4為多形性膠質母細胞瘤的治療靶標。

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2、JQ1抑制GSC的增殖和自我更新

通過細胞計數試劑盒8測定法檢測CSC2078和TS543的細胞生存力,結果如下圖A和B。通過細胞生長計數測定法評估用JQ1處理后CSC2078和TS543細胞的細胞增殖,如下圖C。用JQ1處理10天的CSC2078和TS543細胞的集落形成結果見下圖E和F。圖G和H測量了用JQ1處理10天的CSC2078和TS543細胞的球形形成能力。這些結果表明,JQ1處理可降低神經膠質瘤干細胞的增殖和自我更新。

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3、JQ1和siBrd4通過誘導GSC細胞周期的停滯和凋亡來抑制細胞增殖

圖A和C是將CSC2078和TS543用JQ1處理24小時,將CSC2078細胞用si-NC或siBrd4轉染48小時后通過流式細胞術分析細胞周期,對CSC2078和TS543的細胞周期定量的結果。圖D和F則是將CSC2078和TS543細胞用JQ1處理24小時,用siRNA轉染CSC2078細胞48小時后通過流式細胞術分析細胞凋亡,對CSC2078和TS543的細胞凋亡率定量的結果。結果表明,JQ1或siRNA抑制的Brd4會誘導神經膠質瘤干細胞的細胞周期停滯和凋亡。

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4、JQ1對Brd4的下調可能會促進GSC分化

RNA?Seq分析的結果中CSC2078的神經細胞標志物的倍數變化展示在圖B中,GO富集分析結果見圖A。圖C和D是用JQ1處理48 h的CSC1589細胞中干細胞標記物Nestin的免疫熒光分析結果。 圖E是用JQ1處理24小時的CSC2078細胞中Nestin表達的qPCR結果。這些結果綜合表明,JQ1具有促進神經膠質瘤干細胞分化的潛力。

 

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5、PI3K / AKT信號通路在介導JQ1的抗腫瘤作用中起重要作用。

RNA-Seq中,經JQ1處理后,CSC2078基因上調和下調的基因表達模式的簇熱圖見圖A。JQ1處理與對照后CSC2078上下調的基因數見圖B的火山圖。圖C和F展示了,對照,JQ1處理組和siBrd4組中PI3K,AKT和p-AKT(Ser473)的蛋白質印跡分析表達結果。圖G和H則展示了p-AKT(Thr308)在JQ1處理的CSC2078細胞中的Western印跡分析表達結果。最下面的KEGG富集分析氣泡圖展示了,JQ1處理后,CSC2078的20個顯著富集的KEGG途徑。這些結果均表明PI3K / AKT信號通路在多形膠質母細胞瘤中起重要作用。

 

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6、JQ1通過VEGF / PI3K / AKT信號通路誘導神經膠質瘤干細胞的周期停滯和凋亡 

RNA-Seq結果中CSC2078中與生長因子相關的基因的mRNA表達和JQ1處理后VEGF,MMP9和MMP2表達的蛋白質印跡分析,綜合JQ1和或linifanib處理24小時后,細胞周期定量和細胞凋亡率的結果,表明JQ1和siBrd4通過VEGF / PI3K / AKT信號通路誘導GSC的周期停滯和凋亡。

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7、JQ1在膠質母細胞瘤腫瘤異種移植模型中具有抗腫瘤活性

對JQ1對膠質母細胞瘤腫瘤異種移植模型的治療效果進行評估。TUNEL染,H&E染色和免疫組織化學染色等結果數據綜合表明,JQ1可以有效抑制腫瘤發生和GBM的發展。 JQ1的治療作用可能值得臨床試驗。

 

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結論

本研究旨在探討Brd4和溴結構域抑制劑JQ1對神經膠質瘤干細胞(GSC)的抗腫瘤作用的潛在機制。在體外,JQ1和靶向Brd4的小干擾RNA(siBrd4)抑制GSC的增殖和自我更新。在體內,JQ1顯著抑制異種移植GSCs腫瘤的生長。RNA-seq分析表明,PI3K-AKT途徑在GBM中起重要作用。通過JQ1處理GSC,血管內皮生長因子(VEGF)和VEGF受體2的磷酸化被下調,從而降低PI3K和AKT活性。另外,用JQ1治療抑制了MMP表達,從而抑制了GBM腫瘤中MMP和血管生成對細胞外基質的降解。對AKT磷酸化的抑制,導致視網膜母細胞瘤/ E2F1復合物表達的抑制,從而使得細胞周期停滯。此外,用siBrd4或JQ1處理可通過激活參與凋亡的AKT下游靶基因來誘導凋亡。總之,這些結果表明Brd4具有作為治療靶標的巨大潛力,而JQ1對GBM具有顯著的抗腫瘤作用,這可能是通過VEGF / PI3K / AKT信號傳導途徑介導的。

本研究的RNA-seq測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

文章鏈接:

https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2019.4863#


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