首頁> 市場活動 > 成果展示 > 文章展示 >文章詳情

派森諾無參轉錄組測序文章榮登著名期刊Nature Communications

2019-10-17

微信圖片_20191016102007.png

文章題目:Tropane alkaloids biosynthesis involves an unusual type Ⅲ polyketide synthase and non-enzymatic condensation

發表期刊:Nature Communications

技術手段:無參轉錄組測序

影響因子11.878。


派森諾生物與中科院攜手合作,于2019年9月在《Nature Communications》上發表了關于托品烷的生物合成途徑相關研究成果。



研究背景


托品烷生物堿(tropane alkaloids)是指一類在結構上含有由吡咯環和哌啶環駢合而成的托品烷基本骨架的生物堿,是一類重要的次生代謝物,具有悠久歷史和重要藥用價值的植物源天然產物。現存古代醫學典籍表明,以托品烷生物堿——莨菪堿和東莨菪堿為藥效基礎的茄科植物,如曼陀羅(Datura stramonium)和顛茄(Atropa belladonna),在全世界已經有近兩千年的藥用歷史。目前,莨菪堿和東莨菪堿是臨床上廣泛使用的毒蕈堿型乙酰膽堿拮抗劑,用于鎮痛、麻醉、止痙攣、抗暈動、帕金森癥治療等,具有很大市場需求。

近百年來的基于同位素標記實驗的生物合成研究表明,來源于鳥氨酸的N-甲基吡咯啉陽離子(1)和兩分子的乙酰單元構成了托品烷基本骨架。然而一直以來,植物體中催化N-甲基吡咯啉陽離子和乙酰單元縮合形成托品烷生物堿基本骨架的酶學機制還未見報道。托品烷生物堿的生物合成研究被相關的科學家形容為一個世紀難題(Nat Prod Rep 2001, 18, 494)。


研究方法


中國科學院,以茄科產莨菪堿和東莨菪堿的代表植物——山莨菪屬三分三(Anisodus acutangulus)、顛茄屬顛茄、曼陀羅屬曼陀羅為研究材料,進行轉錄組測序。測序平臺為Illumina Hiseq。


研究結果

1. 三種茄科植物 Ⅲ型PKS基因的鑒定——轉錄組測序

莨菪堿和東莨菪堿存在于多種茄科植物中,包括三分三(Anisodus acutangulus)、顛茄屬顛茄(A. belladonna)、曼陀羅屬曼陀羅(D. stramonium)。構建了這三種植物的毛狀根,通過HPLC分析確認了莨菪堿和東莨菪堿的量(圖1),并進行轉錄組測序。針對轉錄組測序結果,進行轉錄組種內差異表達和種間同源基因分析,發現了這三個植物中分別有4,5,2個潛在的Ⅲ型聚酮合酶unigene,隨后的系統進化樹(圖2)和氨基酸序列比對表明,三種不同植物的AbPKS2、AaPKS4、AaPKS2、AbPKS3和DsPKS1屬于一個分支,其氨基酸序列與文獻報道的AbPYKS17一致。

圖片1.png

圖1 三分三、顛茄屬顛茄、曼陀羅屬曼陀羅三種植物根毛中的托品烷堿HPLC檢測結果



 圖片2.png

圖2 五種潛在的PKS與其他植物細菌中的三型PKS系統進化樹



2. 測定潛在 的PYKS的酶活性

為了在功能上明確這些推定的Ⅲ型PKSs,將這5個蛋白分別在大腸桿菌和丙二酰輔酶a中表達(圖3),并在體外分析它們對底物的活性,化學合成1(圖4)和丙二酰輔酶a。

圖片3.png

圖3 SDS-PAGE分析純化蛋白的體外活性





圖片4.png 

圖4 N -甲基吡咯烷銨陽離子的合成路線

并驗證其能催化N-甲基吡咯啉陽離子(1)與丙二酰輔酶A縮合形成托品烷生物堿生物合成的關鍵中間體2。



3. 蛋白晶體結構的研究

植物型PKSs是一類已知的催化馬來酰輔酶a在協同底物上反復脫羧縮合的酶,可與芳香環產生多種天然產物。在本研究中,Ⅲ型PKSs被鑒定為與非共聚系底物1反應生成非芳香產物,這表明Ⅲ型PKS有可能成為一個新的家族。為了了解催化機理的結構基礎,我們在2.0處確定了AaPYKS的晶體結構(AaPYKS- cob,表1;PDB ID: 6 j1m)。二聚體AaPYKS-COB的整體結構與先前報道的Ⅲ型PKSs的結構高度同源(圖5)。

圖片5.png 

圖5 AaPYKS-COB (PDB ID: 6J1M)和AaPYKS-6 (PDB ID: 6J1N)的晶體結構。


4. 體外酶促反應

體外酶促反應發現這三個 Ⅲ型聚酮合酶利用兩分子的丙二酰輔酶A高效合成了活性的三羰基戊二酸中間體5。該中間體5能與N-甲基吡咯啉陽離子(1)自發的發生Mannich縮合,進而形成托品烷骨架生物合成的消旋中間體2。


總結


該研究不僅解決了托品烷生物堿生物合成中基本骨架形成的機理,回答了長久困擾學術界的一個科學問題,還發現了一類選擇性高效合成三羰基戊二酸的新類型植物 Ⅲ型聚酮合酶,為基于合成生物學的莨菪堿藥物的異源生產奠定了基礎。100年前Robert Robinson的托品酮(Tropinone)全合成是寫入教科書的天然產物全合成的第一個經典案例,長久以來大多科學家堅信該路線是仿生合成。該研究闡釋的托品酮生物合成途徑與100年前的經典化學合成如出一轍,為100年前Robert Robinson的化學合成是仿生合成提供了直接的證據,這也是一個有趣的巧合。

 

本研究的轉錄組測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

文章鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41467-019-11987-z

 


史上最坑爹游戏土地神小坑